Human ACE2-Functionalized Gold “Virus-Trap” Nanostructures for Accurate Capture of SARS-CoV-2 and Single-Virus SERS Detection
Yong Yang*, Yusi Peng, Chenglong Lin, Li Long, Jingying Hu, Jun He*, Hui Zeng, Zhengren Huang*, Zhi-YuanLi, Masaki Tanemura, Jianlin Shi, John R. Lombardi*, Xiaoying Luo*
Nano-Micro Letters (2021)13: 109
https://doi.org/10.1007/s40820‑021‑00620‑8
1. 介绍了一种超灵敏的COVID-19 SERS生物传感器，可在单病毒水平上检测污染水中的SARS-CoV-2病毒。
2. SERS传感器对模拟污染水中的SARS-CoV-2病毒的检测限低至80 copies/mL，时间短至5分钟。
3. ACE2修饰的SERS传感器结合机器学习得出的鉴定标准能够快速检测未知的新型冠状病毒。
2019年12月以来，由新冠病毒(SARS-CoV-2)导致的新冠肺炎(COVID-19)在全球蔓延，给人类生命健康带来了巨大威胁。由于其极快的传染速度，开发快速高灵敏的检测方法对病毒的防控至关重要。目前，国内外已经针对SARS-CoV-2病毒开发了一系列检测方法，其检测对象主要为病毒核酸、病毒抗原及其特异性抗体。在常用的核酸诊断方法中，实时荧光定量PCR核酸扩增法、环介导等温扩增(LAMP)技术普遍使用；酶联免疫分析(ELISA)、胶体金免疫层析法等抗原抗体检测技术对于检测新冠病毒也起了非常重要的作用。但是这些方法存在着复杂的劳动密集型步骤，以及时间(≥1小时)和高成本。因此，方便、快速、经济、高灵敏度的病毒检测仍然是疫情防范的关键技术障碍。中国科学院上海硅酸盐研究所杨勇研究员、黄政仁研究员，与安徽省疾病预防控制中心、上海交通大学仁济医院、华南理工大学、日本名古屋工业大学及美国纽约市立学院科研人员合作，联合开发了一种新冠病毒表面增强拉曼散射(SERS)传感器及快速检测新技术，该传感器具有血管紧张素转换酶2 (ACE2)功能化的金纳米“森林”结构，能够选择性捕获SARS-CoV-2病毒，其检测灵敏度达到了单病毒水平。
借助于该传感器高灵敏性，该工作首次给出了灭活新冠病毒及其表面刺突蛋白(S)、核衣壳蛋白(N)各自独立的标准Raman光谱以及峰位归属理论分析，对于SERS研究领域进一步开展病毒检测研究具有重要指导价值。并通过机器学习手段建立了病毒信号诊断标准和方法，其对SARS-CoV-2病毒最佳检测限优于100 copies/mL，检测时间少于5分钟。这对新冠病毒现场临床检测具有重要意义，同时该方法有望用于快速建立未来未知冠状病毒检测标准和高灵敏现场快速检测。
采用斜角离子束溅射技术制备了有序排列的二维金纳米针阵列SERS基底，如图1a-c所示。精心设计的具有适当斜角和结构参数的高密度纳米针可以形成“病毒陷阱”纳米森林，可对50-100 nm大小的病毒进行定位，诱导病毒落入纳米针阵列，并通过附着在纳米锥体的ACE2受体精准捕获SARS-CoV-2病毒，并阻止病毒逃逸。更有趣的是，这些纳米针呈现出由许多直径约为40 nm的小金纳米颗粒组成的分级纳米结构。这些尖锐的针尖可以诱发“避雷针”效应，积聚的纳米粒子可以表现出“热点”效应，从而协同增强SERS效果。
图1. 金纳米针阵列的微观组织结构及病毒蛋白的SERS光谱分析。(a) GNAs的SEM图；(b) 由倾斜的金纳米针阵列构成的“病毒陷阱”纳米森林示意图；(c) FDTD计算的GNAs的电磁场分布图；(d) SARS-CoV-2 S蛋白、核壳蛋白、SARS-CoV S蛋白、ACE2蛋白的SERS谱图和示意图；(e) 计算的SARS-CoV-2 S蛋白在 Au簇上4种主要个体氨基酸Tyr、Trp、His、Phe的静态拉曼光谱。
SARS-CoV-2病毒直径约为100 nm，比常规SERS可分析的分子要大。在SARS-CoV-2中，SARS-CoV-2病毒被数十纳米大小的S蛋白覆盖。当SARS-CoV-2病毒的表面与金属纳米粒子充分接触时，表面S蛋白将处于“热点”区域，并产生可检测的特征拉曼信号。因此，SERS检测冠状病毒时，其拉曼信号将主要表现为冠状病毒表面S蛋白的Raman光谱特征。我们初步表征了四种蛋白的SERS光谱，分别是SARS-CoV-2刺突S蛋白、SARS-CoV-2核衣壳N蛋白、SARS-CoV S蛋白和人体ACE2蛋白，如图1d-e。这四种蛋白质表现出可区分的拉曼光谱，与计算光谱分析一致。
III SARS-CoV-2 S、SARS-CoV S与ACE2的亲和力
通过测量S蛋白与ACE2的结合时间来寻找ACE2功能化的SERS芯片完全捕获SARS-CoV-2病毒的合适时间。在相同177 nM浓度下，新冠病毒SARS-CoV-2 的刺突S蛋白和SARS的 S蛋白被ACE2功能化的SERS芯片捕获随时间变化的SERS光谱如图2所示。结果表明SARS-CoV-2 S与ACE2结合的亲和力高于SARS-CoV S，说明其感染过程比SARS病毒更快。此外，我们使用ACE2功能化的SERS芯片检测SARS-CoV-2时，发现其检测限LOD可以低到17.7 pM。而在无ACE2修饰的GNAs上滴加SARS-CoV-2 S时，LOD为0.63 nM。上述结果表明SARS-CoV-2S蛋白至少可以得到10⁶倍富集，远高于物理富集法的75倍富集。这可以归因于液相中大多数S蛋白，由于被GNAs表面的ACE2受体捕获而产生浓度梯度，并不断富集在GNAs表面，而不是随机布朗扩散。结果表明，ACE2能够选择性地与表面表达S蛋白的病毒结合，并通过倾斜金纳米针形成物理的“病毒捕集器”纳米结构，对准确捕获和富集SARS-CoV-2具有重要作用。
图2. SARS-CoV-2 S、SARS-CoV S与ACE2的亲和力分析。(a) SARS-CoV-2和SARS-CoV的S蛋白与ACE2功能化GNAs结合示意图；(b, c) 不同浓度的SARS-CoV和 SARS-CoV-2 S蛋白与ACE2功能化的GNAS结合随时间变化的SERS光谱图；(d) SARS-CoV-2 S和SARS-CoV S蛋白与ACE2功能化的GNAs结合不同时间后检测到的SERS信号强度；(e) 将ACE2功能化的和不含ACE2功能化的GNAs浸泡在稀释后的蛋白溶液中检测不同浓度的SARS-CoV-2 S的拉曼光谱强度。
IV 表达SARS-CoV-2 S蛋白和核壳蛋白的假病毒的SERS光谱分析，并建立鉴定标准
本实验构建了两种表达SARS-CoV-2刺突蛋白和核壳蛋白的假病毒株，分别称为VS和VN株。两种病毒都有明显的拉曼特征信号，如图3所示。VS在568、644、884、950、1027、1310、1445 cm⁻¹附近有明显的拉曼光谱带，这也是SARS-CoV-2 S蛋白的主要特征拉曼光谱带。这说明病毒表面S蛋白占据了整个病毒颗粒的关键特征拉曼峰。此外，FDTD模拟的电磁增强位于距离纳米针表面10纳米的区域内。得益于ACE2的高亲和力和对SARS-CoV-2的特异性捕获，SERS衬底将病毒的S蛋白局域在距离表面约10 nm的最强SERS区域内，从而导致新冠S蛋白的高增强拉曼信号。因此，我们检测了真正的SARS-CoV-2灭活病毒(图3a-a)，其SERS光谱表现出与VS类似的Raman光谱特征。为了模拟SARS-CoV-2病毒污染水体的识别场景，分别在健康尿液中混合了两种不同病毒(VS和VN)。通过ACE2-GNAs来检测健康尿液中的两种病毒，与未经ACE2修饰的GNAs来检测PBS溶液中的两种病毒相比，拉曼光谱表现出了略微不同的拉曼峰。尿液中VS在884 cm⁻¹附近具有明显的特征拉曼峰，有别于尿液中的VN。然后，我们据此建立了一个新冠病毒的识别标准来区分健康的尿样和含有VS或VN病毒的尿样。
图3. 基于机器学习方法建立并验证了SARS-CoV-2病毒识别标准。(a) 健康的8岁女孩患者的PBS溶液和尿液中灭活的SARS-CoV-2，VN和VS的SERS光谱；(b) SARS-CoV-2 S位于EM增强区域10 nm处的示意图；(c) 通过PCA对受VS，VN和健康人感染的尿液样本进行分类；(d) DA结果可识别出用于慢性肾炎和含VS的慢性肾炎的尿；(e) DA结果可识别成年人尿液中混合的VS和VN病毒(2200 拷贝/mL)；(f) 对于一个尿液样本的300个测量区域的SERS mapping中，有42个点可以确定为VS阳性。
V 验证基于机器学习方法的SARS-CoV-2识别标准
接下来，我们验证了ACE2-GNAs作为SERS衬底对SARS-CoV-2的识别标准。为了模拟更复杂的多蛋白共存的污染水的检测场景，基于该识别标准检测了健康成人的尿液和含有病毒的慢性肾炎病人的尿液，如图3所示。发现100 个慢性肾炎病人尿液的SERS光谱可以归因于VS-阴性(-)，而100个含VS的慢性肾炎病人尿液的SERS光谱可以正确地归因于VS-阳性(+), 这说明ACE2功能化的SERS基片能够准确地从复杂的多蛋白环境中捕捉病毒和有效区分被病毒感染的尿液。为了证明ACE2功能化GNAs的选择性捕获冠状病毒的能力，用DA方法对混合了VS和VN病毒的成人尿液进行了鉴定分析，如图3e所示。100份混合VS和VN病毒的样本均为阳性，说明在多病毒共存的复杂环境下选择性捕获带有SARS-CoV-2的VS病毒是有效的。
为了评估SERS芯片检测病毒的检测限，检测了含VS的成人尿、含VS的慢性肾炎病人尿和低滴度的VS成人尿。我们发现含VS的成人尿液的6个SERS光谱，以及含VS的慢性肾炎尿液的6个SERS光谱均可归因于VS阳性(+)，证明了VS在复杂的多蛋白共存的污染水环境中仍能被有效的捕获。直到尿液样本中的病毒载量降低到220 copies/mL，9个样本中仍然有4个样本被正确地归为VS阳性(+)。就算尿液中的病毒载量下降到80 copies/mL，任然有42个点被确定为VS阳性(+)，如图3f所示。同时，这也表明ACE2与S蛋白的高亲和力和设计的“病毒陷阱”纳米森林可以协同捕获尿液样本中约70%的VS。我们制备的ACE2功能化SERS芯片对VS病毒的检测限低至80 copies/mL，可与RT-PCR检测方法的灵敏度相媲美。
杨勇
本文第一&通讯作者
上海硅酸盐研究所 研究员
(1)用于能源和环境的纳米材料与纳米传感器件：贵金属和半导体纳米材料和结构的设计和制备，纳米材料的光学和催化特性研究；(2)光学薄膜及其应用；(3)陶瓷增材制造科学。
▍主要研究成果
主要从事材料制备及其光学性能研究。主持研制了国内第一套太空激光雷达用碳化硅光学部件，研发的陶瓷表面改性和光学镀膜技术已经成功应用于北斗导航及实践17号卫星。迄今已在国内外学术刊物如Advanced Science, Nano Energy等刊物上发表SCI收录论文100多篇，受邀为3本外文书籍(英文和日文)各撰写一章。多次参加国际学术会议作邀请报告，取得日本和中国多项授权专利。作为课题负责人承担国家自然科学基金、国家重点研发计划等重大项目，以及中科院“杰出人才计划”和上海市浦江人才计划等项目。
▍Email: yangyong@mail.sic.ac.cn
▍个人主页
sourcedb.sic.cas.cn/zw/rck/200910/t20091010_2541974.html
Nano-Micro Letters《纳微快报(英文)》是上海交通大学主办、Springer Nature合作开放获取(open-access)出版的英文学术期刊，主要报道纳米/微米尺度相关的高水平文章(research article, review, communication, commentary, perspective, letter, highlight, news, etc)，包括微纳米材料的合成表征与性能及其在能源、催化、环境、传感、吸波、生物医学等领域的应用研究。已被SCI、EI、SCOPUS、DOAJ、CNKI、CSCD、知网、万方、维普等数据库收录。2020 JCR影响因子：12.264。在物理、材料、纳米三个领域均居Q1区(前10%)。2020 CiteScore：12.9，材料学科领域排名第4 (4/120)。中科院期刊分区：材料科学1区TOP期刊。全文免费下载阅读(http://springer.com/40820)，欢迎关注和投稿。
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