人工纳米红细胞：提高化疗免疫疗效的药物递送载体

图2. PTX不存在时Eu-FBCP和Eu-s的表征。a，b Eu-s/Cy5.5和Eu-FBCP/Cy5.5的高、低倍扫描电镜图像。通过控制乙醇溶液中Eu的浓度，在不向内喷嘴喷射空气的情况下，制备了尺寸相近的Eu-s/Cy5.5。c-f FACS结果(n=3；荧光曲线和平均荧光强度[MFI])用于比较电喷雾中添加Cy5.5后Eu-FBCP和Eu-s之间MC-38(c，d)或B16(e，f)细胞的摄取，以检查Eu-FBCP因凹形而产生更好的摄取。该分析包括Eu-RL，以确认Eu-RS和Eu-RL之间的吸收差异，为选择Eu-RS提供依据。g Eu-FBCP/PTX在PBS(嵌入数字图像)中的DLS尺寸分布和PDI。h，i Eu-FBCP/PTX的高、低倍扫描电镜(h)和透射电镜(i)图像。j Eu-FBCP/PTX在DW、PBS或RPMI+10%FBS中分散8h后的典型TEM图像研究不同介质的水动力稳定性。k在pH6.5或pH7.4(n=3)条件下，从Eu-FBCP/PTX中释放PTX 48小时。i Eu-FBCP/PTX和Eu-s/PTX以及游离PTX和Eu(RS；电喷雾前)的XRD谱图，考察并比较Eu和PTX的掺入情况。m 用不同浓度的Eu-FBCP/PTX或Eu-s/PTX(50-400μg mL-1)培养红细胞8小时后溶血结果(n=3；**p<0.01 and **p< 0.001)。

II 体外细胞活力与细胞摄取

MTT结果显示，Eu-FBCP和Eu-s(在没有PTX的情况下)均表现出高细胞活性(>95%)，而游离PTX诱导剂量依赖性细胞毒性，显示出28.4μg mL-1的最大半数抑制浓度(IC50)。Eu-s/PTX，Eu-FBCP/PTX的最大半数抑制浓度分别为15.9和9.7μg mL-1，均显著低于游离的PTX。研究显示，Eu-FBCP/Cy5.5的细胞摄取较Eu-s/Cy5.5增加了3倍且Eu-FBCP/Cy5.5主要通过吞噬和大胞饮途径进入细胞。

III 细胞周期与凋亡

Eu-FBCP/PTX诱导85.4%的细胞凋亡(早期和晚期：Q2+Q3)，比Eu-s/PTX诱导的细胞凋亡率高16.8%。线粒体膜电位 (ΔΨm)的丧失是Cyt c从线粒体向胞浆转运的重要标志，是凋亡程序的开始。Eu-FBCP/PTX纳米系统较其它药物组有更强的线粒体损伤效果。

图4. 不同组别的MC-38细胞的体外细胞周期和凋亡分析(1:对照，2:游离PTX，3:Eu-s/PTX，4:Eu-FBCP/PTX)。a 不同处理(1-4)的细胞周期分析结果。Brdu和PI用于计算细胞周期中每个阶段(G1、S或G2/M)的细胞分数。b，c 使用Annexin V-FITC/PI试剂盒(n=3)对24小时治疗(1-4)的凋亡情况和量化数据进行分析。d，e 处理24小时后，细胞的 FACS曲线和JC-1染色的量化数据显示(1-4)细胞(n=3)线粒体膜电位的变化。f，g p53、Bcl-2、Bax、Cyt-c、裂解caspase-9和裂解caspase-3在治疗细胞(1-4)中的代表性表达。h 基于表达(f, g)的治疗细胞(1-4)凋亡的可能机制示意图。i 处理后活/死细胞实验的代表性显微镜AO/PI染色细胞图像(1-4)。

IV 免疫原性细胞死亡诱导的免疫反应

图5. 不同方法处理后，对MC-38细胞进行体外生物测定，以检测ICD诱导的的DC细胞成熟和CD8+T细胞活化。1:对照组，2:游离PTX，3:Eu-s/PTX和4:Eu-FBCP/PTX)。a 治疗组(1-4)HMGB1和CRT的代表性表达，显示ICD的诱导。b 处理细胞后(1–4)CD11c+–CD86+(作为DC成熟的指标)通过产生的TAA来识别DC的成熟。c CFSE-IFN-γ检测CD8+T细胞的增殖和活化。d 处理细胞后(1-4)活化的IFN-γ+CD8+T细胞。

V 体内分布

图6. Eu-FBCP/Cy5.5(或Eu-s/Cy5.5)的体内生物分布及不同处理(1:PBS，2:游离PTX，3:Eu-s/PTX，4:Eu-FBCP/PTX，5:aPL，6:Eu-s/PTX+aPL，7:Eu-FBCP/PTX+aPL)的抗肿瘤免疫反应。a 体内处理后，使用动物成像系统获得浓度范围为1.5625至50.0000微克/毫升的荧光Cy5.5的校准曲线。b 荧光时间影像(0、4、8、12和24小时)检测Eu-FBCP/Cy5.5和Eu-s/Cy5.5以及游离Cy5.5在静脉注射后的肿瘤蓄积情况。c 不同时间点的Cy5.5在肿瘤中的分布。d，e 静脉注射24小时后小鼠主要器官和肿瘤的典型荧光图像和量化数据。f 不同处理方法静脉注射树突状细胞瘤内成熟(1-7)(n =6; *p< 0.05,**p< 0.01, and ***p< 0.001)。g  药物处理后CD4+–CD8+T细胞浸润到肿瘤微环境中(1-7)。g，i 药物处理后肿瘤内浸润CD8+T细胞CD8+–颗粒酶B+和CD8+–IFN-γ+水平图(1-7)。

VI 体内抗肿瘤免疫治疗

图7.  Eu-FBCP/PTX和Eu-s/PTX在aPL缺乏(诱导化学ICD)和存在(增强免疫抗肿瘤活性)情况下的体内抗肿瘤作用(*p< 0.05, **p<0.01, and ***p <0.001)。a 不同处理(1:PBS、2:游离PTX、3:Eu-s/PTX、4:Eu-FBCP/PTX、5:aPL、6:Eu-s/PTX+aPL和7:Eu-FBCP/PTX+aPL)体内抗肿瘤研究的实验时间表示意图。b, c从治疗小鼠(1-7；每组6只)收集的肿瘤大小和肿瘤最终重量的时间分布。d治疗小鼠的存活曲线(1-7；每组10只)。e在从治疗小鼠(1-7只，每组6只)获得的肿瘤切片中，切割的caspase-9、切割的caspase-3、CD8+和肿瘤坏死因子的组织病理学和免疫组化表达。f用PBS(正常)、IgG抗体(Iso-Ab)、CD4抗体(CD4-Ab)、CD8抗体(CD8-Ab)和CD8+CD4抗体(CD4+CD8-Ab)预处理后免疫细胞生成，构建免疫组化MC-38荷瘤小鼠模型。g, h单独用Eu-FBCP/PTX+aPL或Eu-FBCP/PTX治疗的免疫组化小鼠(每组6只)的肿瘤大小和最终肿瘤重量的时间分布。i单独用Eu-FBCP/PTX+aPL或Eu-FBCP/PTX治疗的免疫复合小鼠的存活曲线(每组10只)。