清华李远等：自组装蛋白单分子层表面的二维类冰片状结构

研究背景

蛋白质表面的水合层在多种生物体系中对蛋白质的稳定性、动力学特性和功能性起着关键作用，比如防止蛋白质塌缩、参与蛋白质与配体的特异性识别及与脂质之间的润滑等。尽管已经证明这层水合层是以类冰水的形式存在的，但是其精确的结构以及蛋白质诱导其形成的相互作用机制还需进一步研究。因此，在常温常压且非限域条件下对类冰水的形貌及相关组成的研究有助于进一步阐明水合层和蛋白质间独特的相互作用。

Observation of Ice-like Two-dimensional Flakes on Self-assembled Protein Monolayer without Nanoconfinement under Ambient Conditions

Wuxian Peng, Linbo Li, Xiyue Bai, Ping Yi, Yu Xie, Lejia Wang, Wei Du, Tao Wang, Jian-Qiang Zhong*, Yuan Li*

Nano-Micro Letters (2025)17: 187

https://doi.org/10.1007/s40820-025-01689-1

本文亮点

1. 常温常压且非限域条件下，在自组装单分子层(SAMs)表面进行细胞色素C(Cyt C)的物理吸附及部分脱附后，其表面会形成二维类冰水层。

2. 通过原子力显微镜直接表征二维类冰水层的形貌、成分、融化和结晶过程。

3. 二维类冰水层的形成原因是水在Cyt C表面脱附的活化能比在SAMs表面的高了接近2倍。

内容简介

直接关联蛋白质表面水合层的形态和组成不仅对于研究临界条件下的水结冰过程至关重要，而且也有助于理解生物相关系统中蛋白质-水相互作用的作用。清华大学李远、杭州师范大学钟建强等人提出了一个模型系统来研究室温非限域条件下蛋白质的二维类冰水层，即在自组装单分子层进行细胞色素C (Cyt C)的物理吸附及部分脱附。通过原子力显微镜观察到二维岛状水层均匀分布在SAMs表面，并通过纳米原子力显微镜-红外光谱和拉曼光谱表征了其组成。此外，这些二维类冰片状结构可在高湿度条件下生长或在引入热源后熔化。这些片状物的形成归因于水在Cyt C表面脱附的活化能比SAMs表面高近2倍。本研究为进一步理解水-蛋白质相互作用提供了一种新的有效方法。

图文导读

I 类冰水层的制备过程

图1是二维类冰水层制备过程的示意图，可以分为3个步骤。首先将模板剥离法制备的金(Auᵀˢ，均方根粗糙度低于0.5 nm)基底浸泡在含11-巯基十一烷-1-磺酸钠 (HSC₁₁SO₃Na，1mM) 分子的乙醇溶液中，从而在Auᵀˢ表面自组装一层致密的SAMs (图1a)。其次，将样品在含有Cyt C (1 mg/mL)的磷酸缓冲液(PBS)中浸泡半小时，使Cyt C在SAMs表面进行物理吸附(图1b)。SAMs中带负电的磺酸盐官能团与Cyt C血红素基团中带正电的氨基酸之间会有静电相互作用，促进了Cyt C在SAMs表面的物理吸附。最后，从溶液中取出样品，用PBS溶液连续冲洗，然后用温和的氮气气流干燥表面，使吸附在表面的Cyt C部分脱附(图1c)。随后，使用原子力显微镜(AFM)和纳米原子力显微镜-红外光谱(nano AFM-IR)表征所制备的样品，发现在SAMs表面具有均匀分布且不规则形状的二维片状结构，其厚度从约0.7 nm到约3.3 nm不等，由类冰水和蛋白质组成。整个过程都在常温常压非限域条件下进行。

图1. 类冰水层的制备过程示意图。(a) 在Auᵀˢ基底表面制备HSC₁₁SO₃Na的自组装单分子层；(b) 在PBS溶液中进行Cyt C的物理吸附；(c) Cyt C部分脱附后，SAMs表面的二维片状结构示意图。放大图是这种二维类冰水层的俯视图和侧视图。

II 类冰水的形貌和结构表征

Cyt C部分脱附后，在SAMs(室温，相对湿度RH约为60%)表面观察到高度为0.7~3.3 nm的均匀分布的片状结构，如图2a所示，这与Cyt C的颗粒形态不同。所观察到的不同厚度可能源于Auᵀˢ基底和SAMs的缺陷以及Cyt C的具体吸附状态不同导致每个片状结构所具有的局域压力有所差异引起的。我们将Auᵀˢ表面自组装SAMs的样品分别浸泡于不含Cyt C的PBS溶液和含Cyt C (1mg/mL)的纯水溶液中30min，作为对照组，发现没有观察到如图2所示的二维片状结构，表明Cyt C在PBS溶液中的物理吸附是制备类冰水层的必要条件。考虑到单层水分子的厚度约为0.2 nm，我们制备的类冰水层是由多层水分子组成。我们对二维片状结构的高度进行进一步分析发现其具有三个关键特征：i) 单个片状结构显示出相对均匀的高度；ii) 图2a中的高度分布统计直方图说明薄片的厚度范围为约0.7 nm至约3.3 nm，主要集中在1.0 nm、2.0 nm和3.0 nm；iii) 高度线轮廓线并非完全笔直，片状结构越厚其表面越平坦，这表明表面粗糙度会随着片状结构厚度的增加而降低。

图2. (a) SAMs表面二维片状结构的典型AFM图像(室温，相对湿度RH~60%)，相应的高度轮廓线和片状结构高度分布统计的直方图。Nano AFM-IR的形貌图(b)及在点#1出的nano IR谱图(c)。(d) 3336 cm⁻1处的nano IR的吸收图像与(b)中的片状形貌分布基本吻合。(e) AFM-IR的高度图像及在3336 cm⁻1，3408cm⁻1和3516cm⁻1处的nano IR吸收谱图。在室温、RH~60%条件下进行了AFM-IR表征。

图2b是nano AFM-IR表征的形貌图像，也观察到类似于图2a的二维片状结构。图2c是图2b中点#1的测量nano IR光谱，其中2850~3100 cm⁻1处的吸收峰对应C-H伸缩模式，3300~3500 cm⁻1处的吸收为O-H和N-H伸缩模式。3516 cm⁻1处的吸收归因于背景信号的跳变，而不是Auᵀˢ上分子伸缩振动引起的。3336 cm⁻1处的特征红外波段及3408 cm⁻1处的肩峰为O-H拉伸模式，应注意的是，3336 cm⁻1处的吸收也可能对应于蛋白质的N–H拉伸振动。Nano IR光谱中1300~1900 cm⁻1的光谱范围，我们观察到在1650 cm⁻1处的特征酰胺I键和1542 cm⁻1处的酰胺II键。因此，我们认为所制备的二维片状结构主要由水和吸附的Cyt C组成。Nano IR图像(图2d)中具有3336 cm⁻1强吸收(红色区域)的区域分布与图2b中二维片状结构的形态一致，进一步证明了SAMs上形成了类冰水层。在样品的同一区域收集了红外源分别调整为3336 cm⁻1、3408 cm⁻1和3516 cm⁻1的AFM-IR吸收图(图2e)。在3336cm⁻1和3408cm⁻1处的强吸收区域与二维片状结构的分布基本一致，而在3516cm⁻1处基本观察不到强吸收信号。通过nano AFM-IR表征二维片状结构的形貌和相应的化学组成，证实了SAM表面存在类冰水层，并在常温常压、非限域条件下具有良好的热稳定性。

III 类冰水层的融化和结晶过程

为了深入了解二维片状结构是否表现出典型的冰行为，例如融化和结晶过程，我们在样品的同一个区域连续采集AFM图像，如图3所示。分析了连续扫描引起的局部温度增加对二维片状结构形貌的影响。由于AFM尖端的连续扫描，二维片状结构的表面覆盖逐渐缩小并最终完全消失(图3a)。整个过程非常类似于冰的融化，其原因可归因于在AFM连续扫描期间激光器不断加热探针尖端，导致SAMs表面局部温度急剧升高。考虑到连续扫描后，我们没有观察到任何“液体”留在表面，因此推断蒸发过程可能在冰融化后立即发生。这种融化，然后立即蒸发的行为，进一步表明所观察到的二维片状结构主要由类冰水层组成，并且在常温常压下具有良好的热稳定性。SAMs表面形成类冰水层的机制可能是SAMs表面的磺酸盐基团与Cyt C表面之间的静电相互作用可形成水合层，从而显著提高了水-SAMs界面之间的相互作用，并足以补偿界面水的液-固相变导致的的熵减。我们还发现，将AFM腔体内相对湿度从60%增加到90%，并将样品静置10分钟后，一些二维片状结构的边缘可以向外生长，如图3b中的虚线圆圈所示。因此，我们在室温、非纳米限域条件下，在SAMs表面上直接观察到了二维类冰水层，并且可以通过温度和相对湿度调控其形貌。

图3. (a) 通过AFM针尖的连续扫描，研究了二维片状结构的融化和蒸发过程(室温，RH~60%)；(b)二维片状结构的结晶生长是通过将AFM腔体内的RH从60%提升到90%并且关闭光源，让样品在腔体内静置10分钟实现的(生长区域用虚线圈标出)。

IV 超高真空及低温环境下类冰水层的生长和脱附情况

为深入探究水分子与不同基底(SAMs和Cyt C/SAMs)之间的相互作用机制，我们在超高真空(1×10⁻1⁰ Torr)及低温(110-200 K)环境下，对样品进行了原位红外反射吸收光谱(IRRAS)和程序升温脱附(TPD)实验，结果如图4所示。通过p偏振和s偏振光获取的IRRAS谱线(图4a、b)，不仅提供了关于SAMs和Cyt C的直接信息，还展示了D₂O在这些基底上的生长及脱附情况。在1074 cm⁻1和1666 cm⁻1处的峰，分别对应SAMs的磺酸基团和Cyt C的酰胺基团的特征振动模式。图4a、b中的红色曲线分别代表在两个基底上生长D₂O后的谱线，其中2600-2000 cm⁻1范围内的宽峰对应于OD的伸缩振动带。由于D₂O在两种基底表面生长的差异，导致其主峰位置有所不同。Cyt C的酰胺基团对水的吸附较为敏感，吸附D₂O后，其特征峰发生约4 cm⁻1的红移，且这一变化在水脱附后可逆，而SAMs的磺酸基团在D₂O的吸附过程中保持不变，这进一步凸显了两者在与水分子相互作用上的差异。图4c中的TPD测试谱线则揭示了不同基底上水分子脱附的特性。黑色谱线对应SAMs基底，其在脱附前出现一个小驼峰，表明存在结晶相变过程；而红色谱线对应Cyt C/SAMs基底，其在脱附前没有明显突起，说明几乎没有发生相变，但在169.2 K处出现第二个脱附阶段。由此可见，两种基底上水分子的脱附行为从一开始就呈现出显著差异。

图4. 超高真空下D₂O在基底上生长和脱附的IRRAS及TPD谱线。(a) 110 K时SAMs上生长2.4 L D₂O的IRRAS谱线；(b)115 K时Cyt C/SAMs上生长5.6 L D₂O的IRRAS谱线；(c)2.0 L D₂O分别在110 K和115 K下生长的SAMs(黑色谱线)和Cyt c /SAMs(红色谱线)上的程序升温脱附谱线，其中升温速率都为0.05 K s⁻1。

V 类冰水层在Cyt C/SAMs表面脱附情况的具体研究

为了更全面地理解水分子从SAMs和Cyt C/SAMs表面脱附的动力学过程以及活化能情况，我们通过研究样品在退火过程中IRRAS谱线的特征变化，揭示水分子脱附的具体机制，结果如图5所示。图5a、b展示了随着温度升高，冰薄膜的OD伸缩振动带主峰位置的变化。在SAMs上，一开始主峰位于2517 cm⁻1，对应无定形水(ASW)，在缓慢升温过程中，该峰在向结晶冰(CI)相变时向低波数移动；对于Cyt C/SAMs表面沉积的冰层，其主峰位于2492 cm⁻1。此外，在2729 cm⁻1和2727 cm⁻1处的弱峰分别对应ASW和CI表面的自由OD振动模式(Free OD)。这种差异可能是由于Cyt C/SAMs上的吸附温度略高于SAMs，影响了ASW结构，导致形成更接近CI相的水层，体现了两种基底上冰结构的差异，也不能排除是Cyt C与水分子之间的相互作用对沉积膜性能的潜在影响。

图5c、d呈现了在样品退火过程中，水(冰)薄膜的脱附情况。SAMs上的D₂O在约150 K时完全脱附(图5c)，相比之下， Cyt C/SAMs上显示出两个明显的脱附阶段(图5d)：第一个阶段在120到146 K之间，可能来自SAMs上的D₂O脱附；第二个阶段在大约170 K，归因于Cyt C表面的脱附，表明D₂O与Cyt C之间存在的较强的相互作用。在第二个脱附阶段中，吸附的D₂O发生了相变或结构变化(从ASW相到CI相)，且Free OD的信号消失，进一步凸显了Cyt C表面水分子脱附行为的独特性。

图5e、f通过分析脱附过程中OD伸缩振动带的峰面积的变化，我们利用Polanyi-Wigner方程推导出脱附活化能。结果表明，SAMs上D₂O的脱附活化能Ed−SAMs为61.5 kJ/mol (图5e蓝色数据)。对于Cyt C/SAMs，第一个脱附阶段的活化能Ed−Cyt_1为50.7 kJ/mol(图5e黑色数据)，可能来自SAMs上D₂O的脱附，第二个脱附阶段的活化能Ed−Cyt_2为111.3 kJ/mol(图5f红色数据)，对应于Cyt C上D₂O的脱附。由此可见，D₂O在Cyt C/SAMs上的脱附活化能约是在SAMs上的两倍，这表明水分子在Cyt C上可以在常压和室温条件下形成稳定的二维类冰水层，无需纳米尺度限域。这一结果再次强调了Cyt C与水分子相互作用的特殊性以及其在水分子吸附和脱附过程中的独特性质。

通过整合对制备的二维类冰水层的综合表征和分析，可以得出以下关于Cyt C作用的四个方面的结论：

1. 增强界面相互作用：由于Cyt C上带正电荷的血红素与SAMs上带负电荷的磺酸基团之间的电场作用，二维类冰水层中水-SAMs界面的相互作用显著增强。

2. 促进成核和结晶：SAMs上吸附的Cyt C可以作为异质成核位点，促进类冰水的成核和结晶。

3. 相变行为：Cyt C/SAMs表面上的沉积冰层主要由CI相组成，而不是ASW相，两个不同的脱附区域分别对应于水从SAMs和Cyt C上的脱附。这表明水与Cyt C之间的相互作用显著强于水与金属之间的相互作用。

4. 稳定二维薄片：Cyt C的Ed−Cyt_2比Ed−SAMs高出近一倍，表明Cyt C可以在常压和室温条件下稳定形成二维类冰水层，而不需要纳米尺度限域。

图5. (a) SAMs上生长2.4 L D₂O后缓慢升温退火的IRRAS谱线；(b) Cyt C/SAMs上生长5.6 L D₂O后缓慢升温退火的IRRAS谱线；(c)、(d)分别为(a)、(b)中OD伸缩振动带(黑色曲线)和Free OD(橙色曲线)的积分面积(以及水膜的厚度，一个单层用θ表示)随温度的变化；(e)、(f)是通过Polanyi-Wigner方程分别确定了SAMs和Cyt C/SAMs上D₂O的脱附活化能。其中升温速率都为0.01 K/s。

VI 总结

在本研究中，我们通过HSC₁₁SO₃Na分子形成的SAMs表面物理吸附再部分脱附Cyt C，在常温常压、非纳米限域条件下成功地制备了厚度介于0.7 nm至3.3 nm之间的二维类冰水层。通过综合表征及分析，我们确定了这些类冰水层主要由几层水分子和吸附在SAMs表面的Cyt C组成，表现出对温度和相对湿度较敏感的类冰特性。我们观察到这些类冰水层的熔化和生长过程：一方面，当AFM针尖连续扫描导致局部温度升高时，类冰水层逐渐收缩直至完全消失，类似于冰的融化过程；另一方面，将AFM腔体内的相对湿度从60%提升至90%并保持样品静置10分钟，我们则观察到了类冰水层的生长现象。此外，通过IRRAS和相关的退火过程，我们发现水从CytC/SAMs表面的脱附温度(约171 K)明显高于从SAMs表面(约146 K)。利用Polanyi-Wigner方程，我们计算得出了水从Cyt C脱附的活化能(Ed−Cyt_2=111.3 kJ/mol)约是SAMs的两倍(Ed−SAMs=61.5 kJ/mol)，这进一步证明在常压常压下，蛋白质/SAMs单层膜上有可能形成类冰水层。这项工作提供了一种有效的方法，可以直接关联蛋白质界面上水分子的形态和组成，为进一步探究蛋白质-水相互作用、蛋白质上冰核形成的机制以及蛋白质在水存在下的结构和功能完整性奠定了基础。

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Nano-Micro Letters《纳微快报(英文)》是上海交通大学主办、在Springer Nature开放获取(open-access)出版的学术期刊，主要报道纳米/微米尺度相关的高水平文章(research article, review, communication, perspective, highlight, etc)，包括微纳米材料与结构的合成表征与性能及其在能源、催化、环境、传感、电磁波吸收与屏蔽、生物医学等领域的应用研究。已被SCI、EI、PubMed、SCOPUS等数据库收录，2023 JCR IF=31.6，学科排名Q1区前3%，中国科学院期刊分区1区TOP期刊。多次荣获“中国最具国际影响力学术期刊”、“中国高校杰出科技期刊”、“上海市精品科技期刊”等荣誉，2021年荣获“中国出版政府奖期刊奖提名奖”。欢迎关注和投稿。

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