西交大张明明等：金属笼包封光敏剂实现高效光动力治疗

研究背景

光动力疗法(PDT)因为其较低的耐药性，小的毒副作用以及对正常组织的杀伤更少，可以作为一种很有潜力的与化疗相互补的抗癌策略。PDT中常用的光敏剂一般为大π共轭平面小分子，这类分子由于π -π堆积和疏水相互作用，容易在水溶液中聚集，导致激发态猝灭从而降低单线态氧(1O₂)量子产率，阻碍了它们的广泛应用。利用超分子主体来包裹光敏剂不仅可以防止其聚集并促进1O₂的产生，为高效的光动力治疗提供了一种有效的手段，还可以额外引入诸如靶向、成像剂以及治疗分子来提升超分子光化学治疗的效果。然而，在大多数情况下，超分子主体仅仅作为容器分子来避免光敏剂的聚集，同时利用超分子主体作为能量供体通过荧光共振能量传递来提升光敏剂产生1O₂的能力还几乎未见报道。这类研究不仅可以促进根据具体的应用来设计并制备功能化的超分子主体，还可以有效地整合各种构筑基元来进行协同治疗，从而推动超分子生物材料的发展。

Enhancing the Photosensitivity of Hypocrellin A by Perylene Diimide Metallacage-Based Host-Guest Complexation for Photodynamic therapy

Rongrong Li, Tianfeng Yang, Xiuhong Peng, Qian Feng, Yali Hou, Jiao Zhu, Dake Chu, Xianglong Duan*, Yanming Zhang* and Mingming Zhang*

Nano-Micro Letters (2024)16: 226

https://doi.org/10.1007/s40820-024-01438-w

本文亮点

1. 成功制备了一种新型的金属笼，并将其作为包裹竹红菌甲素光敏剂的超分子主体，阻碍了光敏剂在水溶液中的自聚集。

2. 金属笼也被用作能量供体，通过与光敏剂之间荧光共振能量传递提高光敏剂的单线态氧生成能力，从而实现高效的光动力治疗。

内容简介

开发能够有效包封光敏剂以提高光动力效应的超分子容器，对癌症治疗具有很大的前景。西安交通大学张明明等报道了两种基于苝二酰亚胺的金属笼，它们可以与平面共轭分子(包括多环芳烃和平面型光敏剂)形成稳定的主客体络合物。这种主客体络合物不仅可以阻碍光敏剂在水环境中的聚集，而且可以通过从金属笼到光敏剂的荧光共振能量传递(FRET)，进一步提高单线态氧的生成率(ΦΔ = 0.66)。主客体复合物被进一步用来与两亲性聚合物组装，形成具有更高稳定性的纳米颗粒，用于光动力抗癌研究。体外和体内研究均表明，纳米颗粒在光照射下表现出良好的抗癌活性，在癌症光动力治疗方面具有很大的潜力。本研究提供了一种通过基于主客体络合的FRET增强传统光敏剂疗效的方法，这将有利于促进基于主客体化学的超分子治疗的发展。

图文导读

I 金属笼的制备和表征

Cage 4a或Cage 4b由羧酸钠配体(1)、铂配体(2)和PDI配体(3a或3b)按1:4:1的摩尔比自组装而成(图1a)。Cage 4a和Cage 4b的磷谱分别在5.19和- 0.47 ppm，5.36和- 0.12 ppm处显示出两个双峰(图1b和1c)。每个铂原子与PDI表面的一个吡啶氮和羧酸钠配体的一个氧配位。在氢谱中Cage 4a的α-吡啶基质子Ha和β-吡啶基质子Hb裂分成两组具有明显化学位移的信号(图1d和1e)，分别对应于腔内和腔外的质子。在Cage 4b中，只观察到一组质子(Hf、Hg、Hh、Hi和Hj)，并且所有质子都表现出明显的低场化学位移(图1f和1g)。质谱表明 (图1h和1i)，在m/z = 742.9245、1040.5464、1278.2423、1635.2900、818.8931、957.4337、1141.8347和1400.1527处发现了峰，分别对应于[Cage 4a−8OTf]⁸⁺、[Cage 4a−6OTf]⁶⁺、[Cage 4a−4OTf]⁵⁺、[Cage 4a−4OTf]⁴⁺、[Cage 4b−8OTf]⁸⁺、[Cage 4b−7OTf]⁷⁺、[Cage 4b−6OTf]⁶⁺和[Cage 4b−5OTf]⁵⁺。这些数据与计算值完全一致。这些发现与先前的报道一致，证实了离散的多组分金属笼的成功构建。

由x射线衍射分析Cage 4a的单晶模型(图1j)可知，Cage 4a由两个四吡啶基PDI单元和两个四羧基面板通过八个铂原子连接而成，形成桶状结构。通过测量铂原子之间的距离，Cage 4a的尺寸为1.60 × 1.08 × 1.02 nm3。两个平行PDI面之间的距离为1.25 nm，这是由四羧基配体的长度决定的。由于Cage 4b未能成功长出单晶，因此进行了分子模拟(图1k)来揭示其配位结构。Cage 4b的尺寸为2.48 × 1.35 × 0.86 nm3。由于3b中相邻的吡啶基之间的距离比3a中的要长得多，所以在Cage 4b中，四羧基配体1利用其长边与相邻的两个吡啶基相连，Cage 4b中两个PDI面之间的距离仅为0.98 nm，比Cage 4a中的距离短得多，这有利于客体与金属笼之间的π−π堆积相互作用。因此，可以预期，这两种金属笼都能够络合平面客体分子，而Cage 4b与客体的结合能力应该比Cage 4a更强。

图1. (a) Cage 4a和Cage 4b的自组装示意图；(b, c) Cage 4a 和Cage 4b的部分核磁磷谱 (150 MHz, 乙腈, 295 K)；(d-g) Cage 4a 和Cage 4b的部分核磁氢谱(600 MHz, 乙腈, 295 K)；(h, i) Cage 4a 和Cage 4b的质谱；(j) Cage 4a的晶体结构；(k) Cage 4b的模拟结构。为了清楚起见，省略了氢原子、三乙基膦单元、反离子和溶剂分子。

II 主客体性质研究

考虑到Cage 4a和Cage 4b具有缺电子的PDI单元和合适的空腔，它们与苝(G₃)这种多环芳烃(PAHs)以及光敏剂竹红菌甲素(G₅)的主客体络合被进一步研究。氢谱(图2)显示，所有客体的质子都有显著的高场化学位移，表明Cage 4a和Cage 4b均有效地实现了主客体络合。荧光滴定实验测定了金属笼与芘(G₁)、三亚苯(G₂)、苝(G₃)、晕苯(G₄)和竹红菌甲素(G₅)在溶液中的结合常数(Ka)。Cage 4b与客体的Ka几乎比Cage 4a大一个数量级。这种增强的亲和力可归因于Cage 4b的两个PDI面之间更短的距离，这有利于缺电子的PDI和富电子的多环芳烃之间更强的π−π 堆积相互作用。

图2. 主客体络合的卡通插图。(a) Cage 4a⊃G₃；(b) G₃；(c) Cage 4b⊃G₃；(d) Cage 4a⊃G₅；(e) Cage G₅；(f) Cage 4b⊃ G₅的部分核磁氢谱(600 MHz, 乙腈, 295 K)。[主体] = [客体]= 2mM。

III 纳米粒子的制备与表征

由于G₅的吸收与Cage 4b的发射有很大的重叠(图3b)，因此从金属笼到G₅可能发生FRET。随着G₅逐渐加入到Cage 4b的溶液中，金属笼的发射逐渐降低，而G₅的发射逐渐增加(图3c)，这为G₅和Cage 4b之间有效的能量传递提供了有力的证据。主客体配合物的形成缩短了金属笼供体与G₅之间的距离，提供了良好的能量传递效率。与Cage 4a⊃G₅ (ΦET=36.99%)相比，Cage 4b⊃G₅的ΦET (ΦET=53.37%)值更高。这种FRET过程有望提高材料吸光的能力，从而提高1O₂的生成效率。

为了验证这一假设，使用1O₂清除剂1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)测量了3a、Cage 4a、3b、Cage 4b、G₅、Cage 4a⊃G₅和Cage 4b⊃G₅的1O₂生成的量子产率。随着光照时间的增加，DPBF在410 nm处的特征吸收带逐渐减小，表明1O₂的产生。Cage 4a、Cage 4b、Cage 4a⊃G₅和Cage 4b⊃G₅对应的吸收带几乎保持不变，表明它们具有良好的光稳定性。利用已知效率(ΦΔRB = 0.54)的玫瑰红 (RB)为参照，计算了所有化合物的1O₂量子产率(ΦΔ)。对于3a、Cage 4a、3b、Cage 4b、G₅、Cage 4a⊃G₅和Cage 4b⊃G₅，ΦΔ的值分别为12%、9%、14%、11%、45%、53%和66%(图3d)。综上所述，Cage 4a/Cage 4b和G₅均具有产生1O₂的能力。此外，金属笼和G₅之间的FRET进一步提高了配合物Cage 4a⊃G₅和Cage 4b⊃G₅产生1O₂的效率。值得注意的是，与Cage 4a⊃G₅相比，Cage 4b⊃G₅表现出更高的ΦΔ，这归因于它更好的主客体络合。

图3. (a)由Cage 4b⊃G₅和m-PEG-DSPE2000自组装的NPs 5用于癌症光动力治疗的卡通图；(b) G₅的归一化吸收光谱和Cage 4b的发射光谱；(c) Cage 4b和G₅ (不同浓度的G₅)在乙腈与水(v/v = 1/1)的混合物中的荧光光谱(λex = 365 nm, Cage 4b的浓度为 10μM)；(d)在3a、Cage 4a、Cage 3b、Cage 4b、G₅、Cage 4a⊃G₅或Cage 4b⊃G₅存在的情况下，DPBF在410 nm处的吸收衰减随辐照时间的变化曲线(λex = 520 nm)；(e) NPs 5在乙腈和水中(v/v = 1/1)的光学照片、丁达尔效应照片和荧光照片；(f) NPs 5的SEM图像；(g) DLS法测定NPs 5的粒径分布(c = 1.0 mM)。

基于Cage 4b⊃G₅出色的1O₂生成能力，进一步探索其在癌症光动力治疗中的应用。1,2-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)/聚乙二醇(PEG)偶联物(mPEG-DSPE2000)是一种常用的聚合物，与Cage 4b⊃G₅组装形成纳米粒子NPs 5，进一步用于生物实验(图3a)。NPs 5的照片(图3e)在溶液中呈现出明显的“丁达尔效应”，表明均匀分散的胶体纳米颗粒被制备成功。扫描电镜照片(图3f)显示NPs 5具有直径为140~150nm的胶束结构。动态光散射分析(图3g)显示其平均直径为142 nm，这与SEM结果吻合。这个尺寸范围内的纳米颗粒可以表现出增强的渗透和滞留效应，从而提高了它们的抗癌效果。纳米颗粒的尺寸分布较宽，表明这些两亲性结构较容易在水溶液中聚集。即使在7天后，也没有观察到这些纳米颗粒的尺寸(图3g)的显著变化，这表明NPs 5复合物的较好的稳定性，由于两亲性mPEG-DSPE的保护作用，复合物Cage 4b⊃G₅被很好地置于纳米粒子的疏水内部。

IV 细胞成像与抗癌研究

将Cage 4b、Cage 4b⊃G₅和NPs 5作为造影剂进行生物成像，同时用DAPI染色肝癌MHCC-97L细胞。6 h后，荧光强度达到最大值，荧光强度不随时间增加而增加，因此在孵育后6 h使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)拍摄图像(图4a)，在细胞内观察到来自这些化合物的鲜红色荧光。通过流式细胞术(FCM)分析评估复合物Cage 4b⊃G₅和NPs 5的细胞摄取。在MHCC-97L细胞中(图4b)，观察到NPs 5更强的发射，表明孵育后NPs 5的细胞摄取优于复合物Cage 4b⊃G₅。总的来说，这些发现证实了Cage 4b、Cage 4b⊃G₅和NPs 5作为细胞成像造影剂的适用性。

图4. (a) DAPI与G₅、Cage 4b、Cage 4b⊃G₅或NPs 5孵育后MHCC-97L细胞的CLSM图像；(b)细胞在不同时间用Cage 4b⊃G₅或NPs 5孵育的荧光强度；(c)用3b、G₅、Cage 4b、Cage 4b⊃G₅或NPs 5孵育MHCC-97L细胞时，黑暗/光照条件下对细胞的抑制作用；(d) PBS和NPs 5孵育后MHCC-97L细胞的CLSM图像(激发波长:FDA 488 nm, PI 543 nm;发射滤光片:FDA 500-550 nm, PI 550-650 nm)。

采用3-(4’，5′ -二甲基噻唑-2′ -酰基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)测定法评估涉及2、3b、G₅、Cage 4b、Cage 4b⊃G₅和NPs 5的PDT对人类癌细胞系MHCC-97L的抗癌效果(图4c)。为了保证测试结果的可比性，所有化合物的绝对浓度均设置为1.25 μM。与未经光照处理的化合物相比，所有被试物质在光照下的抗癌活性均显著增强。以NPs 5为例，在没有照射的情况下，检测到少量凋亡和坏死细胞，这可能与金属笼中所含铂(II)的化疗作用有关。然而，当激光照射(50 mW·cm⁻2，白光，1 min)时，对MHCC-97L细胞的抑制率从29%增加到92%。值得注意的是，NPs 5在这些化合物中表现出最高的细胞毒性。这可能归因于从Cage 4b到G₅的FRET的发生，导致Cage 4b、G₅中产生1O₂的效率增加。用双醋酸荧光素(FDA)和碘化丙啶(PI)分别对活细胞和凋亡细胞进行染色，进一步证实了NPs 5的光动力治疗作用。如图4d所示，对照组(PBS、有光照射的PBS和无光照射的NPs 5)呈现绿色荧光活细胞。只有实验组(激光照射的NPs 5)主要显示红色荧光，表明细胞凋亡，进一步证明光动力治疗有效。

进一步进行体内实验，评估2、3b、G₅、Cage 4b、Cage 4b⊃G₅和NPs 5的抗癌活性。本研究采用MHCC-97L荷瘤裸鼠皮下移植瘤模型。首先，在尾静脉注射这些化合物后，对小鼠进行体内荧光成像(图5a)，以评估它们的吸收和生物分布能力。用3b、G₅、Cage 4b、Cage 4b⊃G₅或NPs 5处理后，小鼠肿瘤部位有明显的荧光信号集中。相比之下，在肝脏、肾脏等其他器官中的荧光信号可以忽略不计，表明注射后6小时化合物在肿瘤区域有明显的积累。值得注意的是，NPs 5的荧光信号明显高于其他化合物，表明这些纳米颗粒具有长期荧光，具有良好的肿瘤积累和滞留能力。NPs 5表现出的强荧光使得可以利用成像来监测肿瘤小鼠的药代动力学。注射后，NPs 5呈现持续的全身分布，且定位于肿瘤组织的NPs 5荧光随着时间的推移逐渐增强。注射后6小时的荧光成像显示，与正常器官相比，肿瘤部位的荧光增强。该信号在注射后至少持续12小时，表明NPs 5在样品中的生物分布明显。相反，给药Cage 4b⊃G₅的小鼠全身荧光信号下降更快。这可归因于聚乙二醇化的NPs 5循环时间延长，这显着增强了它们在肿瘤内的渗透性和滞留性。

进一步评估光化学疗法的体内抗肿瘤效果。当肿瘤体积达到~ 100 mm3时，将小鼠随机分为7组(n = 5/组)，分别皮下注射PBS缓冲液、2、3b、G₅、Cage 4b、Cage 4b⊃G₅或NPs 5，剂量均为2 mg kg⁻1，然后进行激光照射(50 mW·cm⁻2，持续30 s)，每2天观察不同组的平均肿瘤大小，连续2周评价治疗效果。所有实验组，包括3b、G₅、Cage 4b、Cage 4b⊃G₅或NPs 5，与给予PBS和2的对照组相比，表现出更好的抗肿瘤活性，治疗后肿瘤大小减小(图5b)。如图5c所示，与PBS组相比，仅接受单次化疗(2)或单次PDT (3b和G₅)的小鼠治疗效果较弱。光化学疗法组(Cage 4b⊃G₅和NPs 5)取得了良好的抗肿瘤结果。值得注意的是，用NPs 5治疗的小鼠在治疗后14天表现出最高的肿瘤生长抑制性，在所有试验组中肿瘤体积最小，这与肿瘤质量结果一致(图5d)。此外，小鼠的体重保持非常相似(图5e)。在所有测试的化合物中，没有观察到体重明显减少，也没有明显的毒性作用迹象，如排尿或神经行为的变化。脾脏肿块(图5f)几乎保持不变，表明这些化合物可以作为治疗癌症的治疗剂。

采用血红素与伊红(H&E)染色法评估肿瘤组织中细胞的增殖和凋亡情况(图5g)。与PBS组相比，所有治疗组都表现出不同程度的坏死，这表明所有测试的化合物都具有一定的抗肿瘤活性。值得注意的是，NPs 5在激光照射下，肿瘤细胞明显缩小和改变，肿瘤细胞凋亡和坏死水平最高，对肿瘤增殖有明显的抑制作用。此外，利用ki67阳性免疫组织化学染色，在图5g中捕获的图像中，细胞增殖区域用棕色斑点标记。值得注意的是，与其他治疗组相比，激光照射NPs 5治疗组ki67阳性肿瘤细胞计数下降最为明显。从本质上讲，这些结果明确证实了通过化疗和激光照射激活的PDT联合实现的增强的协同治疗效果。这些结果表明，金属笼与光敏剂之间的主客体络合作用在提高肿瘤光化学治疗效果中发挥了关键作用，该络合作用已被证明可以通过FRET增加1O₂的生成。

图5. (a)荷瘤小鼠尾静脉注射Cage 4b⊃G₅、NPs 5后的体内荧光成像；(b)第14天不同制剂处理小鼠最终肿瘤组织的数码照片；(c)肿瘤体积变化；(d)肿瘤质量(∗∗p < 0.1，∗∗p < 0.01，∗∗∗p < 0.001)；(e)体重变化；(f)在520 nm (50 mW·cm⁻2)照射下注射不同配方后的脾脏质量(35只荷瘤雌性裸鼠分为7组，n = 5/组)；(g)治疗14 天后各组肿瘤组织术后切片H&E和Ki 67染色(标尺为100 μm)。

V 总结

本研究制备了两种具有不同空腔尺寸的苝二酰亚胺金属笼，并通过主客体相互作用将其进一步用于竹红菌甲素光敏剂的络合。在与金属笼络合后，抑制了竹红菌甲素的聚集。值得注意的是，高效的主客体络合缩短了金属笼与光敏剂之间的距离，为金属笼与光敏剂之间提供了高效的FRET，从而提高了1O₂量子产率。因此，主客体复合物被进一步组装成超分子纳米颗粒用于癌症治疗，体外和体内研究表明的与单一金属笼和光敏剂相比，显示出优越的光动力学活性。本研究提供了一种基于主客体络合的FRET来提升传统光敏剂的光敏性的有效策略，有利于推动金属笼基癌症治疗递送系统的发展。

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Nano-Micro Letters《纳微快报(英文)》是上海交通大学主办、在Springer Nature开放获取(open-access)出版的学术期刊，主要报道纳米/微米尺度相关的高水平文章(research article, review, communication, perspective, highlight, etc)，包括微纳米材料与结构的合成表征与性能及其在能源、催化、环境、传感、电磁波吸收与屏蔽、生物医学等领域的应用研究。已被SCI、EI、PubMed、SCOPUS等数据库收录，2023 IF=31.6，学科排名Q1区前3%，中国科学院期刊分区1区期刊。多次荣获“中国最具国际影响力学术期刊”、“中国高校杰出科技期刊”、“上海市精品科技期刊”等荣誉，2021年荣获“中国出版政府奖期刊奖提名奖”。欢迎关注和投稿。

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